悬浮细胞培养要点解析

Q1

传代时，细胞密度比较低，但是培养基又

变黄了，怎么办？

细胞培养过程中，如发现细胞量较少，但培养基变黄较快，可以从以下3个方面进行排查：

▶ 检查培养基成分是否正常，如NaHCO₃浓度是否偏低；

▶ 检查培养箱内CO₂浓度是否过高，一般培养基添加浓度为1.5g/L或2.2g/L的NaHCO_3，使用5% CO₂进行平衡；添加浓度为3.7g/L的NaHCO₃可使用10% CO₂进行平衡；

▶ 是否存在某种污染物，与细胞竞争营养，导致培养基快速消耗。一般先排除细菌和真菌污染，通过培养法检查即可（不加抗生素培养检查），如排除细菌和真菌污染，可进行支原体检测，确定是否存在支原体污染。

Q2

半换液算传代吗？怎么计算代数？

对于有限传代的细胞，细胞的代次可以用以下公式进行计算：

其中X为传代前代次 ; I 为细胞接种前细胞数；Y 为培养后细胞总数

对于肿瘤细胞或无限传代的细胞，传代数仅仅代表操作的次数，与传代比例和细胞增殖数量没有直接关系；

半量换液的细胞，如果没有进行分瓶培养，建议按照常规的换液来计算，不计入传代次数，如加入新鲜培养基后分瓶培养，则可以将传代数+1。

Q3

本来成团生长的细胞，不成团了怎么办？

细胞是否成团生长，一般是跟细胞本身特性以及培养环境有关的。

如果是本来成团生长的细胞，分散不成团，且增殖速度变慢，可能是细胞状态变差的症状。一般可以从是否污染（特别注意支原体检查）、细胞培养基或血清是否变更以及操作过程是否对细胞产生损伤这三个方面进行排查。

如果细胞仅仅是变成分散状态，但是生长指标都正常，则可能是由于培养条件或环境改变导致的，只要细胞生长正常且没有其他异常症状，不需要过度关注。

Q4

悬浮细胞复苏4-5天进行冻存会影响

细胞活率吗？

细胞是否适合冻存取决于细胞的生长状态，用于冻存的细胞一般要求状态良好，并处于快速增殖阶段。

对于生长速度较快的悬浮细胞，4-5天可以传代1-2次，状态基本恢复，保证细胞处于生长旺盛的对数生长期即可冻存；

但是对于生长速度慢的细胞，4-5天细胞可能还处于状态恢复中，没有大量增殖，此时冻存可能会影响后续复苏的状态。建议复苏后的细胞，培养1-2代，细胞状态良好时进行冻存。

Q5

培养THP-1细胞两周，培养液很容易变

黄，聚团很严重，中间有黑渣渣，怎么办？

如果细胞量没有明显增加，培养基很容易变黄，黑点多且细胞聚团严重，怀疑细胞是存在某种污染，需要排除污染源后重新培养。

Q6

THP-1有少量贴壁细胞怎么处理？

如果出现少量贴壁，每次传代培养时，只收集悬浮部分即可；如果需要完全不贴壁，可以选择低吸附的培养瓶进行培养。

Q7

培养几天后，悬浮细胞的培养基是不是

会变浑浊些？

悬浮细胞和贴壁细胞不一样，培养上清是略显浑浊的，随着细胞量的增加浑浊度也会增加。

可以通过镜检结果来与细菌等污染物进行区分，镜检细胞悬液，细胞间隙应该是干净的，但污染的细胞间隙一般是大量黑色颗粒，有些可以观察到明显的运动。

Q8

THP -1细胞量挺多，但培养基长时间不

变黄，有什么办法？

培养基是否变黄只是细胞传代的参考指标。培养基变黄主要是细胞代谢产物积累导致，同时也会受到培养基的缓冲体系以及培养箱CO₂浓度的影响。如果细胞生长正常，并且到了传代的量，则可以正常传代。

对于THP-1细胞来说，如果细胞数量足够但是培养基不变黄，可能是由于细胞接种时培养基pH值偏高（可能是培养基开启时间过长，CO₂溢出导致的pH值升高），细胞数量虽多但没有明显代谢和增殖，所以颜色不容易变黄。所以建议不要直接分瓶，可以换用新鲜培养基继续观察。

Q9

Sf9细胞静置培养时正常，转入摇瓶悬浮

培养，停滞不长，但也没死，是培养基不

适合悬浮培养吗？

细胞培养条件的变更，如更换培养基，或者由静置培养转为摇瓶培养，都需要一个驯化和适应的过程。

驯化过程，简单说就是缓慢更换培养条件，如将新旧培养基按比例混合，让细胞逐步适应，或者在摇瓶培养前期，调低摇床转速，让细胞逐渐适应。将细胞直接转入新的培养基或培养环境可能导致细胞不长甚至死亡的情况。