疑难解析 | 2023年度直播答疑热点汇总

血清成份复杂，里面包含抑制分化的因子，也包含促进分化的因子；间充质干细胞一类成体干细胞大多可以用血清培养，单能干细胞，用血清不会分化；胚胎干会细胞分化。

血清的刺激分化主要与血清品质相关，品质高的可以维持干细胞增殖，抑制分化；品质较低的如新生牛血清会诱导分化；与生产批次也有关系，不同批次因子含量不一，分化效果不一。

▪ 筛选品质高的血清批次；

▪ 添加抑制分化的因子，如bFGF，EGF等；

▪ 及时传代，控制密度，刺激增殖，高密度会引起分化；

▪ 及时换液，防止代谢累积，刺激分化；

▪ 控制培养基质量如内毒素、支原体、pH等等，控制环境稳定。

细胞密度高的时候，消化3~4 min 才能完全消化下来，细胞高密度下生长速度快，低密度下细胞增殖慢甚至死亡，建议传代比例控制在1:2~1:4，不要超过1:4。

细胞分化了之后是不会再增殖的。细胞分化实验前期，细胞还能缓慢增殖，但随着实验的进展，漂浮的细胞越来越多，这时候要分不同的情况处理：

▪ 如果实验前，细胞长得过满，可能因为接触抑制产生较多漂浮细胞。这种情况下，只要贴壁的细胞没有受到影响，实验可以继续；

▪ 另一种情况，是实验开始时的密度合适，实验开始后，贴壁的细胞慢慢脱落漂浮，这种情况是不正常的，需要结合实验前细胞状态、实验所用的诱导试剂对细胞的影响等多方面的因素去调整。

正常培养的细胞系是没有梯度离心这个概念的，梯度离心通常是用于细胞提取时，多种细胞混合在一起的一种分离措施。悬浮细胞培养的过程中会始终伴随着细胞的死亡，细胞死亡后裂解就会产生碎片。这种可以通过低速离心（800 rpm，3~5 min）去除一部分，但无法完全去除。

悬浮细胞需要计数来判断。贴壁细胞可以看不同视野下细胞的密度，以大多数视野下的密度为准。需要注意的是，不是所有细胞都会平铺单层，有些细胞可能会堆叠生长，比如Hep G2。

THP-1是一类单核细胞，可以在特定的情况下分化为M0型的巨噬细胞，这时的细胞就是会贴壁的。培养的过程中如果发现细胞出现了贴壁的情况，传代的时候可以只收集漂浮的细胞。同时排查实验室的环境、培养基、血清等，看看有没有什么特定的影响因素导致细胞贴壁。

细胞培养传代次数多了，会存在状态越来越差的情况。可以在细胞状态好的时候，一边传代，一边冻存。NK-92细胞有很强的IL-2依赖性，培养时要注意避免过度吹打，团块吹散的同时，细胞也容易受损。培养过程中，一方面需要注意及时添加IL-2，一方面也需要注意吹打次数，一般轻轻吹2~3下将大团吹成小团就可以了。

需要结合具体的细胞及图片具体分析。如果是一些有成脂能力的细胞，不排除是细胞培养的过程中受到某种刺激分化形成了脂滴。除此以外，还需要排除器皿本身的影响。最后结合显微镜下的图片及视频进行判断，看是否有明显微生物的痕迹。如果上述方法都无法判断，必要时，可以收集细胞培养液置于37℃培养箱进行空培养，观察是否有明显的微生物增殖。

细胞复苏后老化，可能是因为细胞冻存前的状态不佳，以及冻存时的保存活性效果不好，这些都会影响细胞状态，其中冻存损伤影响比较常见。建议控制冻存前状态、控制冻存过程及冻存液确保细胞活率。

一般诱导效果好，脂滴大，相差显微镜白光可以观察到油滴，可能会存在误判，建议使用标准检测方法，用油红O染色方法鉴定。

悬浮细胞通常是当天按实验所需细胞量接种细胞，后续配置转染复合物，将转染复合物滴加到培养基中，根据摸索好的转染时间，收样检测。

设置好分组，空白对照、阴性对照、阳性对照、DNA、siRNA、DNA和siRNA共转染（用无血清培养基稀释DNA和siRN及DNA，无血清培养基稀释转染试剂），摸索适宜的浓度、比例、转染时间。

大多数悬浮细胞培养时都会聚团，还有些悬浮细胞本身就是聚团长的，不聚团说明细胞活性较差，如NK-92细胞。培养本身是聚团生长的悬浮细胞，是不可以减少细胞团的。如果是存在少数聚团，大部分单颗悬浮的细胞，可以将细胞进行高密度培养.一般密度在200万/mL时，细胞大部分是单颗分散的。

这是一株对营养要求较高的悬浮细胞，培养的时候需要添加β-巯基乙醇。如果细胞刚复苏就生长缓慢，可以先用台盼蓝染色检测细胞的活性。如果是复苏时生长状态较好，但传代后生长缓慢，可能是培养基的营养不够，比如没有加β-巯基乙醇等。另外，细胞不增殖可能与接种时的密度太低有关。悬浮细胞培养是有密度要求的，一般情况下密度控制在50-200万/mL为佳，密度太低了，细胞增殖缓慢，密度太高了，细胞可能会慢慢裂解死亡。