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细胞学堂 | 大鼠骨髓间充质干细胞的分离提取
来源：Pricella 浏览量： 发布时间：2024-02-20 11:00:00
本期细胞学堂为大家整理了大鼠骨髓间充质干细胞分离提取的方法、注意事项及鉴定指标，帮助您快速上手开展实验。
分离提取步骤
骨髓取材
将大鼠断颈处死后, 置于75%医用酒精内浸泡5~10 min，消毒后将动物转运至超净工作台内。无菌分离双侧股骨和胫骨，用新的剪刀镊子清除股骨胫骨周围肌肉组织；保持骨头完整，留取纯净骨头，将组织转移至新的含有PBS的培养皿内，剪去骨干的两端, 暴露骨髓腔；取注射器，吸取培养基，从骨头一端插针，冲洗骨髓（至骨头发白透亮），反复吹打制成单细胞悬液。
分离方法
BMSCs常见的分离方法有密度梯度离心法、贴壁法以及免疫磁珠分选法，大家可以根据自己实验室条件来选择合适的分离方法。
1
密度梯度离心法
将装有大鼠骨髓液的15 mL离心管，1500 rpm离心5 min；弃上清，用完全培养基重悬沉淀；将培养基重悬的细胞悬液缓慢滴加到Percoll分离液（用PBS稀释）上方，形成密度梯度分离液；2000~2500 rpm离心25 min，吸取中间层的白色雾状细胞层，加入PBS清洗细胞，1800 rpm离心5 min；弃上清，保留细胞沉淀；用细胞完全培养基重悬沉淀，将细胞悬液按1×106/mL密度接种于T25瓶中，于37℃，5%CO2恒温培养箱中静置培养。首次2 d换液，弃去未贴壁细胞, 此后每2~3 d换液一次；待细胞融合达80%后, 用胰酶消化1~2 min后传代培养。
2
贴壁法
也称全骨髓培养法或一步法。将收集的骨髓悬液经200目筛网过滤后，用完全培养基制成单细胞悬液；培养48 h首次换液，弃去未贴壁细胞；此后每2~3 d换液一次，观察细胞的生长及融合程度，待细胞融合80%以上后开始传代培养。
3
流式细胞仪或免疫磁珠分选法
免疫磁珠法和流式细胞仪分选法通过识别细胞表面特异性抗原分离细胞，可获得纯度较高的细胞，但对细胞的活性影响较大，获得的细胞量少，需要特殊的仪器，实际应用受限。
注意事项
鉴定指标
01
细胞形态学观察
刚分离提纯的原代细胞形态呈圆形，大小不一，漂浮于培养液中（图1）。经纯化贴壁后可见，细胞呈成纤维样紧密排列，漩涡样生长，胞核大、清晰、呈长梭形，细胞形态趋于统一（图2），其形态符合BMSCs 的贴壁形态。
图1 大鼠骨髓间充质干细胞刚分离，呈圆形
图2 普诺赛实验室提纯的大鼠骨髓间充质干细胞
02
表面标志物
目前使用较多的是CD90、CD29、CD44等阳性表达指标。
普诺赛实验室提取的大鼠骨髓间充质干细胞CD90表达
参考文献
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