实战分享 | 氧糖剥夺/再灌注细胞模型的构建技巧分享

脑卒中已成为全球第二大死亡原因和第三大致残原因，其中缺血性脑卒中占80%以上。氧糖剥夺/再灌注（Oxygen Glucose Deprivation/Reperfusion, OGD/R）细胞模型是研究缺血性脑卒中的理想细胞模型，它通过短时间内剥夺细胞的营养和氧气，再复糖复氧来模拟体内细胞在缺血缺氧后再灌注的损伤过程。然而，在构建氧糖剥夺/再灌注细胞模型的实际操作过程中，我们可能会遇到各种问题。

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以下两种任选其一即可（方法②更容易实现）：

1

乏氧细胞培养箱（2% O₂, 5% CO₂, 93% N₂三气培养箱）

2

乏氧盒/乏氧袋+厌氧产气袋

主要为以下三种细胞：

1

神经细胞（HT22、SH-SY5Y、PC12细胞系及原代神经细胞等）

2

小胶质细胞（BV2细胞系及原代小胶质细胞等）

3

脑内皮细胞（bEnd.3细胞系及原代脑内皮细胞等）

1

培养基：细胞对应的培养基、无糖培养基

2

其他试剂：FBS、双抗、PBS

3

检测试剂：CCK8

1

将细胞悬液用含有10% FBS的完全培养基稀释，然后以适宜的密度、体积接种在96孔板中（96孔板需设置对照组和实验组，每个细胞接种孔数应满足不少于5个的要求），在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育过夜，使细胞贴壁生长。

2

待细胞贴壁后，从96孔板中弃去各孔中原有完全培养基，用室温的PBS清洗1遍。

3

进行氧糖剥夺处理：在实验组96孔板中，将培养基更换为无糖培养基，并放置在乏氧细胞培养箱或含有厌氧产气袋的乏氧盒/乏氧袋中，培养不同的时间段（如2、4、6、8、10、12 h等）。对照组的培养基更换为新鲜完全培养基，放回37℃，5% CO₂的细胞培养箱中继续培养。

4

进行复糖复氧处理：在达到预定的氧糖剥夺时间后，将实验组的96孔板从乏氧细胞培养箱或乏氧盒/乏氧袋中取出，弃去孔中的无糖培养基，并更换为细胞对应的完全培养基，放置在37℃，5% CO₂培养箱中复氧培养。

5

完成复糖复氧处理后，对照组和实验组同时进行CCK8实验，计算在不同OGD/R造模条件下的细胞存活率。

6

根据实验结果和实验需求，确定最适合的OGD/R模型造模条件。

在后续实验中，需保持细胞接种密度一致（建议细胞汇合度控制在70-80%之间），使用不同规格的孔板进行实验时，需根据每孔面积对细胞数量进行合理换算。

更换培养基时，一定要用室温的PBS轻柔清洗细胞，以去除孔内残留的完全培养基，避免对实验结果产生影响。更换培养基时，动作一定要轻柔，避免对细胞造成损伤。

在进行氧糖剥夺处理时，每孔的无糖培养基体积应适中，不宜太大，避免培养基中溶氧对实验结果造成干扰。一般来说，96孔板每孔加0.1 mL无糖培养基，24孔板每孔加0.2 mL，12孔板每孔加0.5 mL，6孔板每孔加1 mL（具体体积可根据细胞和实验需求进行微调）。

即使是相同的细胞系，不同来源的细胞想要达到相同的细胞存活率，所需的条件也可能会有细微差别。因此，一定要自己用一株细胞去筛选合适的OGD/R细胞造模条件，不可完全照搬文献或他人的方法。

当细胞传代次数过多或状态不好时，采用相同的OGD/R细胞造模条件可能会导致细胞生存率发生显著变化（急剧下降或升高）。此时，应该复苏新的细胞进行实验，以确保实验结果的准确性和可靠性。