细胞凋亡：Annexin V-FITC/PI法的原理及注意事项

　　细胞最主要的死亡方式有2种，包括细胞坏死和细胞凋亡，其中细胞坏死是很早就被发现的，而细胞凋亡是近年来被发现的，并且越来越被重视，最近几年也一直是非常的热门。

　　这是因为，对于细胞凋亡的检测可以用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究，并且还能应用于临床诊疗，新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因治疗，对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位，所以，细胞凋亡才如此火热。

　　大家都知道，检测细胞凋亡的方法有很多，那么，为什么其中Annexin V和PI双染法最为经典呢?这里我们就需要从它的原理开始说起。

　　Annexin V-FITC/PI法的原理：

　　正常细胞(活细胞)具有完好的细胞膜，此时细胞膜的组分之一——磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，当细胞发生凋亡时，细胞膜的结构发生改变，这使得原本在细胞膜内侧的PS外翻到细胞膜的表面，这种现象在凋亡的早期就会出现，因此就可以用与PS具有高亲和力、标记了荧光素的膜连蛋白V(Annexin V)来检测早期凋亡的细胞。

　　由于晚期凋亡和一些坏死的细胞也可以与Annexin V结合，因此需要引入另一种指标来将早期凋亡的细胞与之区分，这种指标就是细胞膜的通透性。与正常细胞和早期凋亡细胞不同，晚期凋亡及坏死细胞的膜通透性会增加，因此，一些原本不能进入到正常细胞内的核酸染料(如PI)便有机会进入细胞内与DNA结合。

　　所以，通过Annexin V和PI双染的方法，就可以把早期凋亡的细胞与晚期凋亡加坏死的细胞区分开来。

　　Annexin V-FITC/PI法的实验步骤：

　　1，细胞按照实验方案进行凋亡诱导，300g离心5min，弃上清，收集细胞，PBS洗涤细胞一次，轻轻重悬细胞并计数。

　　2，取1-5×10^5重悬的细胞，300g离心5min，弃上清。用PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入500μL稀释的1×Annexin V Binding Buffer工作液重悬细胞。

　　3，细胞悬液中加入5μL的Annexin V-APC和5μL的7-AAD染色液。

　　4，轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15-20min。

　　5，反应完成后立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于1小时内完成检测。

　　实验时对照组凋亡比例高的原因

　　1，细胞状态不好;

　　2，细胞收集后存放的时间太长，没有及时染色;

　　3，细胞表面原有的PS相对较多，应选用低浓度的AnnexinV标记;

　　4，PBMC表面往往有血小板黏附在细胞表面，造成Annexin V阳性率偏高;

　　5，过分吹打、震荡或胰酶消化等，可能使PS暴露出来。

　　实验时处理组凋亡比例低的原因

　　1，凋亡刺激得不够;

　　2，细胞本身生长状态可能对刺激因素不敏感，如过度增殖的细胞对凋亡的诱导不太敏感;

　　3，Annexin V的结合缓冲液失效，应4 ℃保存;

　　4，贴壁细胞消化时间过长，膜表面的PS受损，Annexin V结合位点减少。

　　Annexin V-FITC/PI法适合所有细胞吗?

　　最适合悬浮培养的细胞，对于贴壁生长的细胞，最好用不含EDTA的胰酶消化收集，且消化时间不易过长。可将胰酶消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。

　　某些细胞的细胞膜外表面带有大量的PS，因而也不能使用该方法(比如巨核细胞、血小板、某些骨髓系细胞)。

　　其它注意事项：

　　1，必须活细胞检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。

　　2，由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大，因而在消化细胞时，建议一般不采用含EDTA的消化液。

　　3，必须设置阴性对照和补偿对照(分别单染)。

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　　实验效果图如下：

　　图：Jurkat细胞用1μM喜树碱(Camptothecin) (左) 或未加药 (右) 处理4 h，Annexin V-FITC/PI检测试剂盒染色后FCM检测。Annexin V-FITC单阳为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC和PI双阳细胞为坏死或晚期凋亡细胞，PI单阳细胞为裸核细胞。

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