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细胞学堂 | 脂质体细胞转染干货分享
来源：Pricella 浏览量： 发布时间：2022-02-15 15:47:39
在我们的日常基础实验研究中后期，往往会进入到机制的研究，需要研究某个基因或者蛋白对细胞的表型或者功能的影响，大部分都会运用到转染技术。
细胞转染，是指将外源DNA或者RNA片段导入细胞中，从而使细胞获得新的表型的过程。常见的细胞转染的方法，主要有物理介导（电穿孔法、显微注射和基因枪法等）、化学介导（磷酸钙法、脂质体介导法等）、生物介导（各种病毒介导的转染等）三种方法。
评价转染效果的好坏，主要看两个方面：一是较高的转染效率，二是较低的细胞毒性。由于电击法和磷酸钙法的实验条件需要多次摸索优化、难度较大，病毒法的成本较高，前期准备时间较长，所以现在很多普通细胞系，多采用脂质体法。
脂质体转染是利用带正电的阳离子脂质体，与核酸通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA脂复合物，同时也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。
由于这种转染方法具有好的重现性和较高的转染效率，不仅适用于贴壁细胞，对悬浮细胞也适用，所以目前使用的较多。不过需要通过预实验来确定适当的细胞接种密度和转染时间，选择最佳的转染条件。
脂质体转染实验步骤（以lip2000为例）
1、 细胞准备
将处于对数生长期的细胞进行消化，接种到相应的培养皿或者孔板中， 根据细胞的生长快慢，来确定细胞的接种密度，使细胞转染前的密度达到50%~70%，密度不易过大。
2、细胞转染
吸去细胞培养皿/培养孔板中的旧培养基，用预温PBS或者无血清培养基清洗，去除残留血清。更换无血清和双抗的基础培养基（6孔板2毫升/孔），放37度培养箱培养。同时准备转染液，用灭菌后的EP管制备。以六孔板一个孔的量为例：
A液：用250μl Opti-MEM稀释4μg质粒;
B液：用250μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000。
分别将A液、B液轻轻混匀，室温静置5min，将B液全部加入至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。
将转染混合液均匀滴加到每个孔中轻轻混匀，放培养箱培养4 h-6 h后，去除质粒复合物，更换成完全培养基，继续培养到24-48小时(不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。质粒：脂质体=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例，一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率)。以下为不同规格的培养板需要加DNA和lipo2000的量。
转染操作小贴士
1：应使用优质质粒。可以通过测量OD 值来确定DNA纯度和浓度，OD值应介于1.7-1.9之间。脂质体转染基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染，都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
2：混合时需动作轻柔。转染时，小心轻柔地将lipo2000加到培养基中并轻轻混匀，避免粗暴用力吹打，会导致脂质体失效。
3：根据实验需求，提前计算好需用的总质粒量和lipo2000量，大体积地制备，可以减少误差。
4：细胞转染中，使用的是无血清和双抗的培养基。血清的存在会影响DNA-转染复合物的形成，而抗生素在转染试剂增加了细胞的通透性时，也会进入细胞从而间接导致细胞死亡，造成转染效率低。
5：转染后6h更换含血清的培养基，因为lipo2000具有一定毒性。
脂质体转染也存在一定的弊端，目前已有文献研究表明，脂质体可能会抑制ATP酶活性，从而影响细胞的生理活动。尽管如此，目前学界暂时没有其它更高效转染方法。
3、观察转染的效果
在转染后24 h，选择合适的荧光激发光，用荧光显微镜观察实验结果，并记录荧光蛋白表达情况，如下图所示，说明转染成功，且转染效率理想；如果不带荧光，可以用GFP来对照，放在一个单独的孔中，或是与目标质粒共转染，同时用Q-PCR、 WB、FCM来检测。
转染后，如果发现转染效率不高，可以参考以下几点：
1、复转染，即转染后12 h-24 h再次进行转染。前提是该细胞对脂质体的耐受性较好，转染后细胞死亡数较少。
2、通过药筛来杀死未转染成功的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。
3、一般的瞬时转染，随着传代的次数增多，转染效率会随着减低。
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